血清總補(bǔ)體溶血活性（CH50）測(cè)定方法
一、原理
利用綿羊細(xì)胞與相應(yīng)抗體（溶血素）結(jié)合成的復(fù)合物，可激活血清中的補(bǔ)體，導(dǎo)致紅細(xì)胞溶解，當(dāng)紅細(xì)胞和溶血素量一定時(shí)，在規(guī)定反應(yīng)的時(shí)間內(nèi)，溶血程度與補(bǔ)體量及活性呈正相關(guān)。在接近50%溶血（CH50）時(shí)，二者之間近似直線關(guān)系，故以50%溶血作為最敏感的判斷終點(diǎn)。以引起50%溶血所需的最小補(bǔ)體量為一個(gè)CH50U，可計(jì)算出待測(cè)血清中總的補(bǔ)體溶血活性，以CH50U/ml表示。
本實(shí)驗(yàn)主要反映補(bǔ)體經(jīng)典活化途徑的溶血功能，其結(jié)果與補(bǔ)體C1～C9各組成分的量及活性均有關(guān)。
二、試劑及配制
1.緩沖生理鹽水：
（1）貯存液：
Na2HPO4.12H2O 2.85g
KH2PO4 0.27g
NaCl 17.00g
蒸餾水定容至100ml，4℃保存?zhèn)溆?/span>
（2）應(yīng)用液：5ml貯存液加95ml蒸餾水，再加10%硫酸鎂0.1ml，當(dāng)日配制，12小時(shí)內(nèi)使用。
2.2%綿羊紅細(xì)胞：無(wú)菌采取綿羊血液，于等量Alsever液中可保存3周。用前以緩沖液洗3次，并配成2%細(xì)胞懸液。必要時(shí)可用吸光光度法或細(xì)胞計(jì)數(shù)法使懸液細(xì)胞濃度標(biāo) 準(zhǔn)化。
3.溶血素：將綿羊紅細(xì)胞溶血素（效價(jià)1:4000），用應(yīng)用液做1:2000倍稀釋?zhuān)?/span>1ml溶血素加1999ml應(yīng)用液）。
4.待測(cè)血清：新鮮血液室溫放置30min，再4℃放置60min，使血塊收縮，4℃離心（3000r/min）10min，取上清，-20℃保存。
三、操作步驟
試管法（改良Mayer法）
1.致敏羊紅細(xì)胞：2%綿羊紅細(xì)胞加等量稀釋后的溶血素（1:2000），混勻，置37℃水浴30min。
2.稀釋血清：待測(cè)血清0.2ml，加應(yīng)用液3.8ml，稀釋度為1:20。
3.配制溶血標(biāo)準(zhǔn)管：全溶血管:2%綿羊紅細(xì)胞2ml加8ml蒸餾水，混勻。50%溶血管:取全溶血管液2ml加緩沖液2ml。
4.按表所示，依次加各成分于試管中，混勻，置37℃水浴30min，第10管為非溶血對(duì)照：
補(bǔ)體CH50測(cè)定試管法
成 分 | 試 管 號(hào) | |||||||||
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | |
1:20待測(cè)血清（ml） | 0.10 | 0.15 | 0.20 | 0.25 | 0.30 | 0.35 | 0.40 | 0.45 | 0.50 | - |
應(yīng)用液(ml) | 1.40 | 1.35 | 1.30 | 1.25 | 1.20 | 1.15 | 1.10 | 1.05 | 1.00 | 1.50 |
致敏紅細(xì)胞（ml） | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 1 |
5.結(jié)果測(cè)定：取出試管，2000r/min離心10min，對(duì)照管應(yīng)不溶血。肉眼比色，選與50%溶血標(biāo)準(zhǔn)管相近二管，再用分光光度計(jì)測(cè)（波長(zhǎng)542nm、0.5cm比色杯）OD值，確定與標(biāo)準(zhǔn)管最接近者為終點(diǎn)管，然后按下公式計(jì)算CH50值：血清補(bǔ)體CH50（U/ml）=（1/血清用量）×稀釋度。
如第5管為終點(diǎn)管，測(cè)待測(cè)血清中CH50為66.7U/ml。血清補(bǔ)體CH50正常值為50-100U/ml。
在線咨詢(xún)